HyperScript™ First-Strand cDNA Synthesis Kit
![mRNA synthesis](/media/diy/images/page/figure1-mrna.png)
mRNA synthesis
In vitro transcription of capped mRNA with modified nucleotides and Poly(A) tail
![Tyramine Signal Amplification (TSA)](/media/diy/images/page/figure2-01.png)
Tyramide Signal Amplification (TSA)
TSA (Tyramide Signal Amplification), used for signal amplification of ISH, IHC and IC etc.
![screening library](/media/diy/images/page/figure3-01.png)
Phos Binding Reagent Acrylamide
Separation of phosphorylated and non-phosphorylated proteins without phospho-specific antibody
![Cell Counting Kit-8 (CCK-8)](/media/diy/images/page/CCK-8.jpg)
Cell Counting Kit-8 (CCK-8)
A convenient and sensitive way for cell proliferation assay and cytotoxicity assay
![SYBR Safe DNA Gel Stain](/media/diy/images/page/SYBR Safe DNA Gel Stain.png)
SYBR Safe DNA Gel Stain
Safe and sensitive stain for visualization of DNA or RNA in agarose or acrylamide gels.
![Inhibitor Cocktails](/media/diy/images/page/Inhibitor Cocktails.jpg)
Inhibitor Cocktails
Protect the integrity of proteins from multiple proteases and phosphatases for different applications.
- 1. John K Barrows, Michael W Van Dyke, et al. "A CsoR family transcriptional regulator, TTHA1953, controls the sulfur oxidation pathway in Thermus thermophilus HB8." J Biol Chem. 2023 Jun;299(6):104759. PMID: 37116710
- 2. JianPing Zhang, XiaoQiao An, et al. "Identification and cellular validation of the relevant potential biomarkers associated with female lung adenocarcinoma." Research Square. 28 Nov, 2023.
- 3. Rathnayake RAC, Yoon S, et al. "Electrospun Silk Fibroin-CNT Composite Fibers: Characterization and Application in Mediating Fibroblast Stimulation." Polymers (Basel) 2022 Dec 26;15(1) PMID: 36616441
- 4. Bing Li, Ge Lou, et al. "Repression of lncRNA PART1 attenuates ovarian cancer cell viability, migration and invasion through the miR-503-5p/FOXK1 axis." BMC Cancer. 2022 Jan 31;22(1):124. PMID: 35100978
- 5. Qijun Wang, Fubi Jin, et al. "Lipoxin A4 promotes adipogenic differentiation and browning of mouse embryonic fibroblasts." In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2021 Dec;57(10):953-961. PMID: 34811702
- 6. Jing Yang, Jinzhe Zhou, et al. "Hollow CeO2 with ROS-Scavenging Activity to Alleviate Colitis in Mice." Int J Nanomedicine. 2021 Oct 8;16:6889-6904. PMID: 34675513
- 7. Hongrong Wang, Shasha Song, et al. "Long non-coding RNA HOTAIR knockdown alleviates lipopolysaccharide-induced acute respiratory distress syndrome and the associated inflammatory response by modulating the microRNA-30a-5p/PDE7A axis." Exp Ther Med. 2021 Oct;22(4):1160. PMID: 34504605
- 8. Yu-Qing Pan, Min Niu, et al. "Effect of MT2A on apoptosis and proliferation in HL60 cells." Int J Med Sci. 2021 Jun 4;18(13):2910-2919. PMID: 34220318
- 9. Yonglei Liu, Lixia Wang, et al. "Ramelteon Ameliorates LPS-Induced Hyperpermeability of the Blood-Brain Barrier (BBB) by Activating Nrf2." Inflammation. 2021 Oct;44(5):1750-1761. PMID: 33876343
HyperScript™ First-Strand cDNA Synthesis Kit是基于HyperScript™ Reverse Transcriptase(货号:K1071)从Total RNA或Poly(A)+RNA合成第一链cDNA的试剂盒。HyperScript™ Reverse Transcriptase是在M-MLV (RNase H-) Reverse Transcriptase基础上经过基因工程改造后获得的全新逆转录酶,相较而言HyperScript™ Reverse Transcriptase降低了RNase H活性且大幅度提高了热稳定性。HyperScript™ Reverse Transcriptase可耐受更高的反应温度,适用于具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录。此外,HyperScript™ Reverse Transcriptase增强了与模板的亲和力,适合少量模板以及低拷贝基因的逆转录,可合成长达12.3 kb的第一链cDNA。
HyperScript™ First-Strand cDNA Synthesis Kit包含合成第一链cDNA所需的所有组分,并提供Random Primers和Oligo (dT)23VN 两种cDNA合成引物。可根据实验需要选择Random Primers、Oligo (dT)23VN或基因特异性引物作为逆转录引物,合成的第一链cDNA产物可用于后续的PCR扩增、qPCR反应等实验。
基于高效的HyperScript™ Reverse Transcriptase,适用于具有二级结构的RNA 模板
合成第一链cDNA片段可长达12.3 kb
可检测低至1 pg的模板起始量
Kit中提供的Oligo (dT)23VN引物比Oligo (dT)18对模板锚定能力更强,逆转录效率更高
合成的第一链cDNA 可用于PCR 扩增、qPCR 反应等实验
组分 | 20 rxn(20 μL reaction) | 50 rxn(20 μL reaction) | 100 rxn(20 μL reaction) |
HyperScript™ Reverse Transcriptase (200 U/μL) | 20 μL | 50 μL | 100 μL |
5X First-Strand Buffer | 80 μL | 200 μL | 400 μL |
RNase Inhibitor, Murine(40 U/μL) | 20 μL | 50 μL | 100 μL |
10 mM dNTP Mixture | 20 μL | 50 μL | 100 μL |
RNase Free ddH2O | 1 mL | 1 mL | 1 mL x 2 |
Random Primers (50 μM) | 20 μL | 50 μL | 100 μL |
Oligo (dT) 23VN (50 μM) | 20 μL | 50 μL | 100 μL |
所有组分储存于-20°C。 |
1)Q:收到产品后应怎么保存?
A:所有组分-20°C保存,有效期至少1年。
2)Q:能否通过延长逆转录时间来提高逆转录效率?
A:对于大多数基因,延长逆转录时间对逆转录效率并没有明显的提升;但对于一些GC含量较高或含高级复杂结构的模板,延长逆转录时间可提升逆转录效率。
3)Q:原核生物RNA能否用该逆转录酶?
A:可以。因为原核生物的RNA没有poly A尾,在逆转录反应体系中需要选择Random primer作为逆转录引物。
4)Q:逆转录反应引物如何选择?
A:常用引物类型包括:随机引物、Oligo dT和基因特异性引物,选择情况如下:
a. 随机引物:随机结合在RNA的任何区域,适用于rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA类型的逆转录反应。
b. Oligo dT:适用于具有Poly A尾的RNA(原核生物RNA、真核生物的rRNA和tRNA是不具有PolyA尾的)。由于Oligo dT结合在PolyA尾上,所以对RNA样品的质量要求较高,即使有少量的降解也会使全长cDNA合成量大大减少。
c. 基因特异性引物:与模板序列互补,适用于序列已知的基因逆转录。
当cDNA后续是用于qPCR实验时,一般使用Oligo dT和随机引物的混合物,可以避免3’端和5’端的扩增偏好性;当cDNA后续是用于PCR扩增长片段时,一般用Oligo dT或者基因特异性引物,不建议使用随机引物。因为随机引物是随机结合的,cDNA片段会偏短,可能会对长片段扩增造成稀释,后续扩增不出全长的目的基因。
5)Q:可以通过测逆转录产物cDNA的浓度来判定逆转录的效率吗?
A:可以通过测逆转录产物cDNA的浓度来判定逆转录的效率吗?
6)Q:逆转录产物用PCR扩增后跑胶检测无特异性条带?
A:可能原因及解决方案如下:
a. 引物设计欠佳或逆转录产物质量欠佳:可先使用actin、GAPDH等作为内参进行PCR扩增,看是否可以成功扩增。如果内参不能被很好地扩增,则有可能PCR引物存在问题或逆转录产物质量欠佳。
b. 模板RNA发生了降解:哺乳动物细胞或组织的总RNA琼脂糖电泳后应该可以看到清晰的18S和28S rRNA条带,并且28S rRNA和18S rRNA的亮度比例应该大于等于2.0,如果比例小于2.0,则说明总RNA发生了显著的降解,需重新制备模板。
c. 模板RNA的纯度偏低:在提取纯化RNA的过程中,残留在溶液中的一些成分如苯酚、SDS、EDTA等会抑制逆转录酶活性。可对RNA样品进行柱纯化,或者进行沉淀、洗涤和再溶解,通常可以有效去除残留的污染物。
d. 逆转录模板量不足:在抽提获得总RNA后,在进行一些精细的定量检测时通常会进行DNase I消化,以充分去除可能的残留的DNA的干扰。DNase I进行热失活时,需要加入EDTA至终浓度为2.5mM,否则RNA在没有螯合剂的情况下,在加热过程中容易被水解,从而导致模板量不足。此外,扩增特定基因时,需要先查询该基因的组织分布特点,利用其高表达的组织进行目的基因的反转录和克隆。
e. 逆转录引物类型选择不当:对于细菌RNA和不含poly A尾的RNA,要用随机引物代替Oligo(dT)引物。使用基因特异性引物时,需要确保基因特异性引物设计合理正确。
f. RNA模板富含GC或容易形成二级结构:可考虑把反转录温度提高到45-55℃。